羥基磷灰石修飾的磁珠（hydroxyapatite magnetic bead）是硅基磁珠經(jīng)羥基磷灰石官能團(tuán)改性制得。 該珠子是非常有用的色譜介質(zhì)，可用于快速純化和分餾各種生物物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和抗體，無(wú)需繁雜的重復(fù)移液和離心。 羥基磷灰石有兩個(gè)不同的吸附位點(diǎn); 與酸性基團(tuán)結(jié)合的鈣位點(diǎn)和與堿性蛋白質(zhì)基團(tuán)相互作用的磷酸鹽位點(diǎn)。 由于其獨(dú)特的混合模式“離子交換特性，羥基磷灰石不僅具有獨(dú)特的分離性能，無(wú)與倫比的選擇性和分辨率，而且對(duì)蛋白質(zhì)和抗體具有非常大的結(jié)合能力。 此外，羥基磷灰石不結(jié)合游離氨基酸或小肽，使其對(duì)蛋白質(zhì)純化非常有利。
產(chǎn)品名稱(chēng)
PuriMag Si-HA; PuriMag Si-[Ca5(PO4)3OH]2
濃度
50mg / ml
平均尺寸
0.4μm（+/-0.04μm）
材料
硅基磁性材料
磁分離
<30 S
儲(chǔ)存
2-8°C軟化水中
結(jié)合能力
>20ug protein (BSA)/mg bead
比表面積
~100m2/g
一、蛋白純化方案
注意：以下方案是采用PuriMag Si-HA羥基磷灰石修飾的磁珠純化蛋白質(zhì)的實(shí)例。為獲最佳結(jié)果，用戶(hù)可用替代的結(jié)合、洗滌或洗脫緩沖液，并鼓勵(lì)根據(jù)注釋部分中描述的方案和建議確定最佳工作條件。我們建議進(jìn)行滴定以?xún)?yōu)化每種應(yīng)用所需磁珠的量。 可相應(yīng)地縮放洗脫體積以避免不必要的樣品稀釋。
l 建議將一水磷酸二氫鈉和七水合磷酸氫二鈉用于預(yù)處理緩沖液和結(jié)合/洗滌緩沖液配制。
l 避免使用無(wú)水磷酸鈉，因?yàn)檫@些鹽含有阻止一些大分子結(jié)合的焦磷酸鹽。
l 避免高濃度的鹽或螯合劑如EDTA，因?yàn)樗鼈儠?huì)阻止蛋白質(zhì)與磁珠結(jié)合。
l 氯化鈣可以加入磷酸鹽緩沖液中以提高結(jié)合效率，用于酸性蛋白質(zhì)純化。
磷酸鹽緩沖液中氯化鈣濃度: 0.3 mM calcium chloride for 10 mM phosphate buffers; 0.01 mM calcium chloride for 300 mM phosphate; 0.0075 mM calcium chloride for 400 mM phosphate.
l 預(yù)處理緩沖液: 200 mM Sodium phosphate, pH 9-10
l 結(jié)合/洗滌緩沖液: 10 mM Sodium phosphate, pH 6.8, 0.3 mM calcium chloride
l 洗脫緩沖液: Gradient of increasing concentration of 10-600 mM potassium phosphate, pH 7.0
A.樣品準(zhǔn)備：將蛋白質(zhì)樣品置于50倍體積的結(jié)合緩沖液進(jìn)行透析。
B.磁珠準(zhǔn)備 注意：用100 mM磷酸鈉，20%乙醇（磁珠濃度：50 mg / ml）懸浮磁珠，并在4℃下儲(chǔ)存.（可能需要非常輕柔地超聲處理珠子完全分散珠子。）
1）搖動(dòng)瓶子，使磁珠完全重懸。將40μl磁珠（2mg）轉(zhuǎn)移到離心管中。磁分離，除去上清液。
2）用200μl預(yù)處理緩沖液重懸磁珠，室溫下2-3分鐘。磁分離，除上清液。重復(fù)該步驟一次。
3）從分離器中取出離心管，用200μl結(jié)合/洗滌緩沖液重懸磁珠。磁分離，除去上清液。重復(fù)該步驟一次。
4）用100μl結(jié)合/洗滌緩沖液重懸磁珠。
C.樣品結(jié)合
1）將含~40μg蛋白質(zhì)的樣品加入上述洗過(guò)的磁珠中。用移液槍充分混合磁珠，在室溫下放置2-3分鐘。
2）將試管放在磁分離器上1-3分鐘，除去上清液。
3）取出離心管，用200μl結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠。磁分離，除去上清液。.重復(fù)該步驟三次。
D.蛋白質(zhì)洗脫：注意：蛋白質(zhì)可用濃度逐漸增加的磷酸鹽緩沖液（10-600 mM）和/或pH梯度（5.5或更高，達(dá)到樣品蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性極限）或NaCl用于堿性蛋白質(zhì)洗脫，但是不是酸性蛋白質(zhì)。
1）從分離器中取出管子。用10-20μl洗脫緩沖液重懸珠子，并在室溫下放置3分鐘。
2）將管置于磁分離器上1-3分鐘，將含洗脫蛋白的上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。
二、DNA純化方案 注意：對(duì)于所有緩沖液配制，建議采用一水磷酸二氫鈉和七水合磷酸氫二鈉。避免使用無(wú)水磷酸鈉，因?yàn)檫@些鹽含有焦磷酸鹽，會(huì)阻止某些大分子結(jié)合。
l ?樣品裂解緩沖液：8M Guanidine hydrochloride
l ?結(jié)合/洗滌緩沖液：100 mM phosphate buffer pH 7, 4 M guanidine hydrochloride
l ?洗脫緩沖液：0.5M phosphate buffer pH 7 (4M guanidine hydrochloride -optional)
l ?稀釋緩沖液：0.2 M phosphate buffer pH 7
A.樣品準(zhǔn)備：樣品預(yù)處理是成功純化高質(zhì)量基因組的關(guān)鍵步驟。不同生物樣品需不同方法裂解細(xì)胞釋放DNA。許多培養(yǎng)的細(xì)胞可在裂解液渦旋均質(zhì)化，而動(dòng)物/植物組織、酵母和細(xì)菌需更嚴(yán)苛裂解過(guò)程。不同樣品參考下表。
Sample
Soft tissue
Hard tissue
Plant tissue
Fungi
Yeast
Bacterium
Liquid nitrogen
+
Frozen grinding
Homogenize
Lysozyme
Lyticase, zymolase
Sonication
Glass bead grinding
1）將100mg預(yù)處理的生物質(zhì)溶于1ml樣品裂解液。為促進(jìn)裂解，55℃搖床中下孵育1h至過(guò)夜。
2）在室溫下以13,000rpm離心3~5分鐘除去細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，用2×稀釋緩沖液將上清液濃度調(diào)至4M鹽酸胍。
B. 磁珠準(zhǔn)備
1）搖動(dòng)瓶子，重懸磁珠。將20μl-30μl磁珠（50mg / ml）轉(zhuǎn)移至離心管中。磁分離，除去上清液。
2）用200μl結(jié)合/洗滌緩沖液重懸磁珠。置于室溫下2-3分鐘。磁分離，除去上清液。重復(fù)該步驟三次。
3）用100μl結(jié)合/洗滌緩沖液重懸磁珠。
1）將樣品與磁珠混合，室溫下溫育10-15分鐘，同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)。磁分離，除去上清液。
2）用200μl結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠。磁分離，除去上清液。重復(fù)該步驟三次。
D. DNA洗脫：從分離器中取出離心管，用10-50μl洗脫緩沖液重懸磁珠，在室溫下放置3分鐘。磁分離，然后將含有洗脫DNA的上清液轉(zhuǎn)移到新試管中。
E. DNA沉淀
1）向洗脫的DNA溶液中加入等體積的d2H2O。加入0.1倍體積的5M乙酸銨和2.5倍體積的100%EtOH，使DNA在-20℃下沉淀至少15分鐘（優(yōu)選1小時(shí)或更長(zhǎng)）。
3）以13,000rpm離心15分鐘。棄上清液。向沉淀中加入2ml冰冷的70％乙醇并輕彈/攪拌管以重懸沉淀。
4）以13,000rpm離心15分鐘。丟棄上清液。讓DNA風(fēng)干（15分鐘即可）。將DNA重懸于適量的d2H2O或TE緩沖液中（注意：基因組DNA不易溶解，65°C下5分鐘有助于溶解）。
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