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MS-PRA001
1 ml
MS-PRA010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
蛋白A磁珠MagStart-Protein A是一種專有的磁性聚合物微粒，提供了一種簡單方便的抗體捕獲方法，適合后續(xù)各種靶分子富集，以及生物樣品中各種抗體/免疫球蛋白的高度特異性富集。MagStart磁珠是一種超多孔聚合物網(wǎng)絡(luò)，允許生物分子在整個微粒內(nèi)滲透和結(jié)合。MagStart-Protein A的高載量反過來又轉(zhuǎn)化為靶生物分子的極高結(jié)合量。與MagReSyn?Protein A有等同效果。
重組蛋白A（~41 kDa）與磁微粒共價連接，可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而有可能使蛋白質(zhì)在非標(biāo)準(zhǔn)條件下應(yīng)用。共價鍵有助于減少蛋白A從磁珠泄漏。MagStart蛋白A與其它市售蛋白A磁微粒相比有更出色的抗體結(jié)合能力，抗體純度高達(dá)97%以上，可舍去其它純化分離步驟。蛋白A磁珠的應(yīng)用包括血清樣品中的免疫球蛋白去除、抗體分離以及后續(xù)抗體靶標(biāo)免疫沉淀，用于下游應(yīng)用，例如：通過質(zhì)譜、免疫測定或電泳進(jìn)行分析。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of IgG molecules, Immunoprecipitation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Protein A (~41kDa)
Binding capacity
≥2.4 mg/ml IgG (Rabbit)
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
15 mg/ml in TBS [50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.025% Tween? 20, 0.05% sodium azide (NaN3)]
Stability
pH 2~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當(dāng)儲存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
MagStart-Protein A微粒極高的官能團(tuán)密度為生物分子偶聯(lián)提供了高濃度的反應(yīng)位點。MagStart-Protein A的高結(jié)合載量允許減少高活性功能微粒的體積來實現(xiàn)實驗方案小型化，進(jìn)而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應(yīng)用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過磁壓縮減少了洗滌和洗脫過程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強(qiáng)磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
2. 免疫球蛋白純化流程
可能影響抗體附著的因素包括免疫球蛋白的同種型、緩沖液組成和 pH 值，以及污染物/干擾化合物的存在。磁珠的數(shù)量需要針對每個單獨的應(yīng)用進(jìn)行優(yōu)化。我們建議使用過量的配體來確保蛋白A磁珠的飽和度。結(jié)合效率可以通過比較偶聯(lián)前后的配體濃度來確定。MagStart-Protein A與各種常用緩沖液兼容，推薦的緩沖液包括：
結(jié)合/洗滌緩沖液 - TBS（pH 7.5, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.025% Tween 20）或 PBS（pH 7.5, 50 mM Phosphate, 150 mM NaCl，0.025% Tween 20）；
洗脫緩沖液（非變性）：0.1 M glycine，pH 2.5 或 2.5% acetic acid；
洗脫緩沖液（變性）：SDS-PAGE eletrophoresis buffer。
注意：所有試劑都應(yīng)是分析級且新鮮制備，以確保最佳性能。下面的程序、方法和緩沖液僅供參考，并非限制。MagStart-Protein A與一系列不同緩沖液兼容，用于結(jié)合抗體?？蓪崿F(xiàn)的純度和產(chǎn)率取決于配體，應(yīng)優(yōu)化實驗條件以確保獲得預(yù)期結(jié)果。
關(guān)于MS兼容性的注意事項：如要通過MS進(jìn)一步分析富集的靶標(biāo)，請考慮在初始洗滌步驟后使用替代的無去垢劑緩沖液，以去除可能干擾MS分析的殘留去垢劑。這可能包括不加洗滌劑的初始緩沖液，然后用揮發(fā)性無鹽緩沖液（如碳酸氫銨、甲酸銨、三乙基碳酸氫銨）洗滌 2-3 次。
2.1. MagStart-Protein A磁珠的平衡
磁珠以15 mg/ml的TBS懸浮液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.025%Tween?20和0.05% NaN3作為防腐劑）的形式提供，適用于純化≥2.4 mg/ml的IgG（兔）。在使用前，需去除運輸溶液并在結(jié)合緩沖液中平衡磁珠。對蛋白A磁珠的等分試樣進(jìn)行多重結(jié)合反應(yīng)，如下所述。每次反應(yīng)至少需要10μl的微粒懸浮液，以確保緩沖液的抽吸具有合適的顆粒尺寸。下面概述的結(jié)合和洗脫方案可作為示例，并可根據(jù)您的要求進(jìn)行縮放。
1） 通過渦流混合或倒置徹底分散MagStart-Protein A磁珠，以確保均勻懸浮。
2） 轉(zhuǎn)移50μl 磁珠（足以捕獲約120μg兔IgG）到新的管中。
3） 磁分離，吸棄運輸溶液。
4） 加入300μl結(jié)合緩沖液（例如TBS或PBS）中洗滌/平衡磁珠，允許磁珠平衡至少1分鐘。
5） 將離心管放在磁分離器上，澄清后移液管吸棄結(jié)合緩沖液。
6） 重復(fù)步驟4和5兩次（總共3次洗滌）。
7） 從步驟6中去除結(jié)合緩沖液后，MagStart-Protein A準(zhǔn)備就緒，可用于結(jié)合靶免疫球蛋白。
2.2. 從血清或培養(yǎng)液中純化免疫球蛋白 (Ig)
1) 計算應(yīng)用所需的MagStart-Protein A磁珠的體積，并轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。例如，50 μl 蛋白A磁珠（0.75 mg）足以結(jié)合 ≥ 120 μg 兔 IgG。
2) 用至少 90 μl 結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋 10 μl 樣品，渦旋攪拌 3 秒。樣品量可根據(jù)需要調(diào)整，但至少要用9份結(jié)合緩沖液來稀釋樣品（如，100 μl 樣品和900 μl 緩沖液可與 50 μl磁珠一起使用）。
3) 通過倒置或渦旋攪拌將樣品與磁珠混合。室溫下孵育至少10分鐘，以確保蛋白A與免疫球蛋白之間的有效結(jié)合。結(jié)合效率與時間和配體有關(guān)，孵育時間可延長至1小時，以提高抗體產(chǎn)量。
4) 將試管放在磁分離器上，磁分離澄清。
5) 用移液管吸出偶聯(lián)上清液。上清液可丟棄或分析以確定 Ig 容量。
6) 用至少3×500 μl結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠，去除磁珠上未結(jié)合Ig和/或不需要的樣品蛋白質(zhì)。
7) 每次洗滌后，磁分離，用移液管吸出上清液。
8) 各洗滌步驟的上清液可與偶聯(lián)上清液混合進(jìn)行定量或凝膠電泳（如需要）。
9) 現(xiàn)在可以按 2.3 中所述從微粒中洗脫捕獲的 Ig，或用于免疫沉淀（3.1；從步驟 7 開始）。
10) 可選： 此時可將結(jié)合的抗原或抗體進(jìn)行脫鹽或緩沖液替換，方法是用適合下游應(yīng)用的緩沖液/水進(jìn)行洗滌。
2.3. 回收/洗脫捕獲的免疫球蛋白
捕獲的免疫球蛋白可通過加入低 pH 值的洗脫緩沖液（如 pH 值為 2.5 的 0.1 M 甘氨酸或 2.5% 乙酸）從微顆粒中洗脫出來。
1) 向包被捕獲 Ig 的 磁珠中加入 50 μl 洗脫緩沖液，持續(xù)充分混合。洗脫體積可根據(jù)要求調(diào)整；但洗脫體積過低可能會對Ig產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。
2) 讓捕獲的 Ig 在室溫下從微粒中洗脫1-2分鐘。
3) 磁分離，移液管吸出含洗脫的溶液。該溶液可用于量化洗脫Ig的濃度，或用凝膠電泳分析。
4) 可重復(fù)步驟1-3，以提高洗脫的回收率。
5) 匯總洗脫液，加入 5-7 μl 的5 M NaOH 或 1 M Tris pH 9.0 中和洗脫液的 pH 值。
6) 純化的Ig可用于定量或下游分析。
3. 免疫沉淀流程
MagStart-Protein A磁珠還可用于直接或間接免疫沉淀（IP）反應(yīng)的抗體捕獲。對于直接 IP，用戶指定的抗體（Ab）首先通過蛋白 A-抗體介導(dǎo)的結(jié)合與磁珠相連。這些免疫親和磁珠隨后用于從血清或細(xì)胞裂解物等粗樣品中特異性捕獲感興趣的抗原（如生物大分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物）。IP 的另一種方法是先將用戶指定的抗體與含抗原的樣品孵育，形成抗原-抗體復(fù)合物。然后將用Protein A磁珠進(jìn)行捕獲。間接 IP 可能還包括通過使用第二抗體（通過親和捕獲固定在 MagStart-Protein A磁珠上的抗抗體）從樣品中捕獲抗原抗體復(fù)合物。
3.1. 免疫沉淀 (IP) 程序
由于 IP 有多種變化，以下方案僅指導(dǎo)原則作示例。具體的 IP 參數(shù)可能會發(fā)生變化，因此需進(jìn)行優(yōu)化，這些參數(shù)包括：抗體和配體的數(shù)量、樣品濃度、孵育時間、溫度和緩沖液成分、樣品濃度、孵育時間、溫度和緩沖液成分。 以下方案可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，用于直接或間接 IP洗脫。
1) 按照 2.1.步驟 1-6 準(zhǔn)備蛋白 A 磁珠并平衡。
2) 去除最后的結(jié)合/洗滌緩沖液后，用 100 μl 結(jié)合/洗滌緩沖液重懸MagStart-Protein A磁珠。
3) 在磁珠懸浮液中加入捕獲抗體（每 50 μl 最多 120 μg）。
4) 室溫孵育10-30分鐘使捕獲抗體固定在磁珠上。
5) 磁分離，吸出抗體溶液（棄掉或用于定量）。
6) 用 300 μl 結(jié)合緩沖液（如 TBS 或 PBS）洗滌磁珠三次。
7) 最后一次洗滌后，將離心管從磁力架上取下，加入含目標(biāo)抗原樣品（最終體積至少為 500 μl，用于末端混合）。
8) 輕輕倒置混合均勻，在 2-8°C下持續(xù)混合孵育?？贵w與抗原相互作用的最佳時間可能會有所不同（請參考抗體制造商推薦的孵育時間；通常范圍為 1 小時至過夜）。
9) 磁分離吸出樣品溶液，丟棄或用于下游分析。
10) 用 300 μl 結(jié)合/洗滌緩沖液洗滌磁珠三次。洗滌液可與步驟 9 中的樣品溶液合并進(jìn)行分析。
11) 可選： 此時可將結(jié)合的抗原或抗體進(jìn)行脫鹽或緩沖液交換，方法是用適合下游應(yīng)用（如質(zhì)譜分析）的緩沖液/水進(jìn)行洗滌。
12) 抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物可根據(jù) 2.3 從微粒中洗脫出來。
4. 抗體結(jié)合指引
5. 試劑適應(yīng)性
MagStart-Protein A 磁珠相容組成如下:
Reagent
Concentration
Tween? 20
≤1%
Tris, Sodium phosphate, Triethanolamine
≤100 mM
NaCl
≤1 M
6. 常見問題
問題
可能原因
改善方法
抗體未如預(yù)期那樣與微粒結(jié)合
反應(yīng)時間不足
將反應(yīng)時間擴(kuò)充到1小時
不正確的結(jié)合pH
檢查和調(diào)整結(jié)合液pH7.4-8.0
樣品或溶液中的干擾物阻止結(jié)合
將樣品脫鹽或透析到推薦的結(jié)合液中，以去除培養(yǎng)基成分/其他污染物
微粒數(shù)不足
增加顆粒的數(shù)量
生物分子含量過低
通過樣品濃度增加抗體含量或制備更多起始材料
抗體與蛋白A不相容
蛋白A并非多所有抗體特異
生物分子的非特異吸附
離子或靜電作用導(dǎo)致的非特異吸附
增加結(jié)合、洗滌、洗脫緩沖液中的NaCl濃度；增加結(jié)合洗滌液中吐溫20濃度
洗滌不充分
增加洗滌次數(shù)、洗滌液體積和平衡時間
低的看題洗脫回收率
洗脫條件太溫和
增加洗脫時間，替換洗脫緩沖液，務(wù)必保證洗脫緩沖液pH<3.0
洗脫后蛋白失活
蛋白在洗脫液中可能不穩(wěn)定或失活
替換洗脫緩沖液，或立即使用5 M NaOH 或 1 M Tris pH 9.0中和洗脫液
參考文獻(xiàn)：
1. Maimela P W M, Smith M, Nel A J M, et al. Humoral immunoprofiling identifies novel biomarkers and an immune suppressive autoantibody phenotype at the site of disease in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Frontiers in Oncology, 2024, 14: 1330419.
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